Методы исследования белков icon

Методы исследования белков



НазваниеМетоды исследования белков
Дата конвертации21.05.2012
Размер68.42 Kb.
ТипДокументы

Белок и всё о нём в биологии и химии {belok-s.narod.ru}

Глава 7. Методы исследования белков

7.3. Определение первичной структуры белков


Определение первичной структуры белков сводится к выяснению порядка расположения аминокислот в полипептидной цепочке. Эту задачу решают с помощью метода секвенирования (от англ. sequence  последовательность).

Собственно секвенирование на его сегодняшнем уровне позволяет определить аминокислотную последовательность а полипептидах, размер которых не превышает несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время исследуемые полипептидные фрагменты значительно короче тех природных белков, с которыми приходится иметь дело. Поэтому необходимо предварительное разрезание исходного полипептида на короткие фрагменты. После секвенирования полученных фрагментов их необходимо снова сшить в первоначальной последовательности.

Таким образом определение первичной последовательности белка сводится к следующим основным этапам:

  1. Расщепление белка на несколько фрагментов длиной, доступной для секвенирования.

  2. Секвенирование каждого из полученных фрагментов.

  3. Сборка полной структуры белка из установленных структур его фрагментов.

Для специфического расщепления белков по определенным точкам применяются как ферментативные, так и химические методы. Из ферментов, катализирующих гидролиз белков по определенным точкам, наиболее широко используют трипсин и химотрипсин. Трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расположенных после остатков лизина и аргинина. Химотрипсин преимущественно расщепляет белки после остатков ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана. При необходимости специфичность трипсина может быть повышена или изменена. Например, обработка цитраконовым ангидридом исследуемого белка приводит к ацилированию остатков лизина. В таком модифицированном белке расщепление будет проходить только по остаткам аргинина.

Наряду с ферментативными методами используются и химические методы расщепления белков. Для этой цели часто применяют бромциан, расщепляющий белок по остаткам метионина:


CHR

CO

CH

NH

CO

CHR

CH

NH

CO


NH

NH

CO
gif" align=left hspace=12>

CH2

CH2

BrCN


CH2

CH2

Br

CH3SCN


N C

SCH3

S+CH3


O


NH3+

N+H

NH

CHR

CO

CH

NH

C

CHR

CO

CH

C

+


H2O

O

CH2

O

CH2





CH2

CH2

^ С
H+
еквенирование
проводят методом, известным как метод Эдмана. Последовательная обработка полипептида, имеющего свободную концевую -аминогруппу, каким-либо алкил- или арилизотиоцианатом в слабощелочной среде приводит к образованию соответствующей тиомочевины, которая в умеренно кислой среде приводит (при значениях кислотности, не повреждающих пептидной связи) отщепляется в виде соответствующего тиогидантоина. Оригинальная процедура Эдмана основана на использовании фенилизотиоцианата и тем самым на образовании фенилтиогидантоинов:

+ Ph  NCS

CHR1CONHCHR2CO

NH

Ph

NH2CHR1CONHCHR2CO

C

NH


O

S


C


CHR1

Ph

NH

+ NH2CHR2CO


NH

C


S



В результате образуется фенилтиогидантоин, содержащий боковой радикал аминокислоты R1, который может быть идентифицирован путем измерения какой-либо физической или физико-химической характеристики, позволяющей различать гидантоины, соответствующие разным входящим в состав белков аминокислотам. В качестве такой характеристики может служить хроматографическая подвижность в какой-либо предварительно проградуированной по стандартным образцам гидантоинов системе или молекулярная масса, определяемая с помощью масс-спектрометра.

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградации дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередующихся процедур: добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде пригодном для следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения вех перечисленных операций  автоматические секвенаторы полипептидов. С их помощью удается произвести до 40  60 шагов ступенчатой деградации.

Завершающим этапом установления первичной структуры белка является восстановление порядка, в котором просеквенированные фрагменты располагались в исходном полипептиде. Чаще всего для этой цели используют подход известный как метод перекрывающихся белков. Ниже излагается основная идея метода.

Если установлена структура всех полипептидов, полученных расщеплением исследуемого белка с помощью трипсина (далее такие полипептиды обозначаются буквой Т  от слова “трипсиновые”), то остается определить для каждого из этих пептидов, с какими двумя Т-пептидами он соседствует с N- и С-конца. В структуре просеквенированных Т-пептидов такая информация полностью отсутствует. Однако ее можно частично, а в ряде случаев и полностью восстановить, если располагать аналогичными данными для серии полипептидов, полученных расщеплением того же исследуемого белка по какой-либо другой группе аминокислотных остатков. Для определенности ниже речь будет идти о полипептидах, полученных расщеплением химотрипсином (пептиды группы С, chymotryptic).


N

T’’

T’

С-пептид содержит:

а  соседние пептиды T’ и T’’; б  пептид T’ и N-конец пептида T’’; в  пептид T’’ и С-конец пептида T’; г  С-конец пептида T’ и N-конец T’’



C



а

C

N



C


N

б


C-конец

в

C


N


N

C


г




Как видно из рисунка, если два Т-пептида являются соседними в исходной цепи, то существует С-пептид, который либо содержит в своем составе полностью оба или один из рассматриваемых Т-пептидов, либо как минимум содержит С-концевую часть левого и N-концевую часть правого пептида группы Т. этот С-пептид перекрывает два соседних Т-пептида, с чем и связано название метода.

Таким образом, просматривая структуры пептидов Т и С, можно для любой пары Т-пептидов выявить, являются ли они соседями в исследуемом белке или разделены одним или несколькими другими Т-пептидами. Неоднозначность может появиться только в том случае, если перекрываемый каким-либо из С-петидов концевой фрагмент встречается у двух или нескольких Т-пептидов. Вероятность этого как правило невелика. Если это все же происходит, то применяют более сложные методы комбинаторики.







Похожие:

Методы исследования белков iconМетоды исследования белков
Все методы разделения смесей основаны на том, что разделяемые компоненты в результате каких-либо манипуляций оказываются в разных...
Методы исследования белков iconМетоды исследования белков
Среди методов, используемых в биохимии, ключевое значение имеют выделение веществ из биологических источников и, как правило, их...
Методы исследования белков iconМетоды исследования белков
Если в такую систему ввести разделяемую смесь в виде некоторой зоны, то по мере ее перемещения компоненты смеси, движущиеся с разными...
Методы исследования белков iconВключает различные отделы: исагогика; герменевтика, экзегетика
Библеистика как наука, ее происхождение, предмет, методы исследования, различие теологического и секулярного взгляда на природу Библии,...
Методы исследования белков iconРезюме Цель
Институт геологии и нефтегазового дела.(Геофизические методы исследования скважин)
Методы исследования белков iconДокументы
1. /Рузавин Г.И. - Методы научного исследования. М., 1975.pdf
Методы исследования белков icon«методы и техники социологического исследования»
Министерство образования российской федерации санкт-петербургский государственный университет
Методы исследования белков iconДокументы
1. /готово/10 Понятие о темпераменте.doc
2. /готово/12...

Методы исследования белков iconХимический состав белков
Химический анализ показал наличие во всех белках углерода (50-55%), кислорода (21-23%), азота (15-17%), водорода (6-7%), серы (0,3-2,5%)....
Методы исследования белков iconХимический состав белков
В настоящее время в различных объектах живой природы обнаружено до 200 различных аминокислот. В организме человека их, например,...
Разместите кнопку на своём сайте:
Документы


База данных защищена авторским правом ©podelise.ru 2000-2014
При копировании материала обязательно указание активной ссылки открытой для индексации.
обратиться к администрации
Документы

Разработка сайта — Веб студия Адаманов